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Laboratorio 3: Estrazione del DNA da un tessuto vegetale

La procedura che viene impiegata in questa esperienza si basa sul fatto che la membrana esterna delle cellule e quella del loro nucleo è composta da sostanze grasse (fosfolipidi) e che possono essere demolite usando del detergente (detersivo per piatti).

Una delle prime operazioni da compiere è quella di frammentare il frutto in modo da separare il più possibile le cellule fra loro per esporle all'azione del detersivo.

Poi si aggiunge una soluzione di sale da cucina e detersivo alla polpa del frutto, liberando il DNA dalle membrane che lo trattenevano.

Si filtra il materiale per lasciar passare l'acido nucleico e trattenere i residui cellulari.

Infine il DNA viene fatto precipitare in alcool etilico (alcool denaturato) poiché in tale sostanza non è solubile e dove diventa visibile come una massa gelatinosa.

Materiale:

• Un kiwi o una banana
• Un sacchetto robusto di plastica per conservare i cibi nel congelatore
• 3 g di cloruro di sodio (un cucchiaino di sale da cucina)
• 10 mL detergente (tre cucchiaini di sapone liquido per le mani o detersivo per i piatti)
• 100 mL d’acqua (mezzo bicchiere da cucina)
• Alcool etilico freddo (alcool denaturato)
• 2 becher (due bicchieri)
• Carta da filtro (2 pezzi di carta assorbente da cucina)
• Imbuto
• Contenitore di raccolta
• Contenitore con acqua calda (60°C).
• Bagno refrigerante (contenitore con ghiaccio)

Procedimento

1) Sbucciare il frutto e tagliarlo in piccoli pezzi.

2) Mettere la polpa del frutto nel sacchetto di plastica. Senza annodarlo chiudere il sacchetto cercando di togliere prima tutta l'aria.

3) Frantumare la polpa con le mani, per circa 2 minuti.

1. 4) Intanto preparare la soluzione di estrazione, fare sciogliere in un becher un cucchiaino da tè di sale da cucina in circa 100 mL di acqua (mezzo bicchiere da cucina) e poi aggiugere 3-4 cucchiaini di detersivo, mescolare!

5) Quando la polpa è stata ridotta in poltiglia, aggiungere la soluzione d’estrazione; togliere tutta l'aria e annodare il sacchetto, continuate a schiacciare la polpa per altri 5 minuti.

6) Mettere il sacchetto in un recipiente con acqua a 60 °C per 15 minuti (l'alta temperatura facilita la rottura delle membrane cellulari e disattiva gli enzimi che attaccano il DNA).

7) Raffreddare il preparato mettendo il sacchetto nel bagno refrigerante di ghiaccio (non raffreddare a temperatura ambiente perché il protrarsi dell'alta temperatura potrebbe frammentare il DNA).

8) Intanto preparare un filtro con i due fogli di carta assorbente, si mette il filtro sull'imbuto appoggiato su un contenitore di raccolta.

9) Tagliare un angolo del sacchetto e versare il miscuglio nel dispositivo di filtrazione.

10) Raccogliere il massimo volume di filtrato.

11) Distribuire nelle provetti circa 6 mL di filtrato (due dita)

12) Versare lungo il bordo della provetta con l’aiuto di un becher un volume di alcool freddo uguale a quello del filtrato facendo attenzione a che le due soluzioni non si mescolino, si deve formare uno strato di alcool sulla superficie del filtrato. Questa è la fase più delicata si consiglia di tenere inclinata la provetta con il filtrato, e versare l’alcool lentamento facendolo scorrere lungo le pareti.

13) Sul momento si formano delle bollicine di aria, trascorsi alcuni minuti è possibile osservare nell'interfaccia acqua-alcool (superficie di separazione tra la soluzione acquosa e l’alcool) una sostanza trasparente dalla consistenza gelatinosa che va via via aumentando: è il DNA. L'alcool rende il DNA insolubile, che diventa quindi visibile.

Analizziamo le due fasi dell'esperimento:

• Una volta preparata la frutta è necessario liberare il DNA dall'involucro cellulare. Per permettere al DNA di uscire dalla cellula e di "srotolarsi", senza perdere la struttura a elica, occorre sia demolire pareti e membrane cellulari, che allontanare gli istoni che sono le proteine che permettono al DNA di avvolgersi e ripiegarsi ripetutamente su se stesso. Il cloruro di sodio (il normale sale da cucina) agisce sulle proteine legate alla molecola del DNA; mentre il detergente agisce sulle membrane cellulari. (Il sale da cucina, NaCl, in soluzione acquosa si dissocia completamente in ioni Na+ (ioni sodio) e Cl- (ioni cloruro). La presenza di questi ioni modifica (denatura) la struttura delle proteine, in particolare degli istoni, cambiandone la disposizione spaziale, consentendo al DNA di separarsi da esse. La temperatura a 60° serve a facilitare la rottura delle membrane e a disattivare gli enzimi che attaccano il DNA. Il bagno reffrigerante in ghiccio abbassa la temperatura perché il protrarsi dell'alta temperatura potrebbe demolire il DNA .
• In fase terminale si aggiunge l'etanolo, che pur essendo solubile in acqua, non si miscela all'estratto cellulare per il suo minore peso specifico. L'etanolo viene aggiunto molto lentamente e fatto scivolare lungo la parete della provetta, in modo che, essendo più leggero dell'acqua, non si mescoli con essa ma vi galleggi sopra. Si hanno così due fasi: in alto l'etanolo più leggero in basso l'estratto cellulare con il DNA in soluzione (il DNA è molto solubile in acqua). Nell'interfasea tra etanolo ed estratto il DNA entra in contatto con l'etanolo e precipita.

Laboratorio 3: Costruire un modello in carta di DNA

In questo laboratorio si è costruito un modellino in carta di un tratto di DNA

Materiale occorrente:

• matite colorate;
• forbici;
• colla;
• fotocopia da ritagliare con modello di DNA (clicca sul link che segue per scaricare il file in formato pdf del modellino di DNA  “CSIRO’s Double Helix Science Club”)

Scoperta della struttura del DNA

Struttura del DNA

Gli acidi nucleici sono molecole formate da moltissimi atomi quindi sono delle macromolecole.

Esistono due tipi di acidi nucleici il DNA e RNA

Genetica: gli esperimenti di Mendel e la prima legge della genetica

Il monaco agostiniano Gregor Mendel fu il primo a studiare, applicando il metodo scientifico, il fenomeno della trasmissione dei caratteri ai discendenti cioè l’ereditarietà dei caratteri. 

Gli studi condotti da Mendel nell’arco di otto anni permisero di formulare le leggi che stanno alla base dell’ereditarietà dei caratteri.

Medel è considerato il padre della scienza che studia l’ereditarietà dei caratteri cioè la GENETICA.

Nel piccolo giardino dell'abbazia agostiniana di San Tommaso della di Brünn, nella Moravia meridionale (Repubblica Ceca).

Giardino dell'abbazia di San Tommaso

Mendel compi i suoi studi sperimentali sulla ereditarietà dei caratteri studiando la pianta del Pisum sativum.

Pianta di pisello (Pisum Sativum) 

Mendel pubblicò i risultati dei suoi esperimeti in un lavoro diretta alla Società di storia naturale di Brünn dal titolo: “Esperimenti sull’ibridazione delle piante”. 

Frontespizio di
“Esperimenti sull’ibridazione delle piante”

Gli studi di Mendel rimasero pressoché sconosciuti al mondo scientifico e solo 16 anni dopo la sua morte la sua pubblicazione fu riscoperta e si capì l’IMMENSO VALORE dei suoi risultati

Perché Mendel scelse la pianta del pisello?

• Pianta di facile coltivazione.
• Pianta di rapido sviluppo e in breve tempo si ottengono più generazioni.
• Pianta con molte varietà con caratteri diversi.
• Ciascun carattere presenta varianti ben distinguibili l'una dall'altra.
• Particolarità del fiore 

Il fiore porta entrambi gli organi sessuali cioè è ERMAFRODITA .

L’antera del pistillo, cioè la parte maschile,  produce il polline e lo stigma, cioè la parte femminile riceve il polline.

Fiore di pisello con la camera petalica aperta
si osservano lo stigma e i pistilli

La disposizione dei petali (camera petalica) permette l'AUTOFECONDAZIONE e impedisce l'impollinazione incrociata tra piante diverse.

Mendel studiò l’erediarietà di sette caratteri. Ciascun carattere presenta due varianti antagoniste.

Di seguito i sette caratteri studiati da Mendel e per ciascun carattere sono indicate le due varianti antagoniste.

Mendel lavorò su piante di pisello che fecondava artificialmente: con un pennellino trasportava il polline del fiore di una pianta su quello di un’altra dopo aver eliminato in questo le antere.

Mendel studiò prima come si trasmetteva un solo carattere alla discendenza, per esempio il colore del fiore nelle varianti antagoniste viola e bianco.

Per prima cosa Mendel selezionò piante di RAZZA PURA per alcuni caratteri.

Ad esempio:

Isolò piante, dal fiore viola che davano sempre, autoimpollinandosi, piante con fiore viola, e piante dal fiore bianco che autoimpollinandosi davano sempre piante con fiore bianco.

Mendel, una volta che si fu assicurato di aver piante pure per un determinato carattere iniziò la fecondazione incrociata: ad esempio, prelevò del polline da una varietà dal fiore bianco e lo andò a depositare sul pistillo di una varietà dal fiore viola, questi individui costituiscono quella che si chiama generazione parentale (si indica col simbolo P)

Mendel, aspettò che i frutti maturassero, prelevò i semi, li seminò e aspetto che le nuove piante, che vengono chiamate prima generazione filiale (si indicano col simbolo F1), nascessero e fiorissero, osservò che la prima generazione filiale, era costituiti da piante che avevano tutte i fiori viola, e nessuna pianta aveva fiori bianchi.
In generale considerando un certo carattere, le piante somigliavano sempre ad uno solo dei genitori. 

Da questa prima parte della sperimentazione deriva la PRIMA LEGGE DI MENDEL:

Incrociando due individui appartenenti a linee pure, che differiscono per un solo carattere, si ottengono individui in cui compare solo un carattere che viene detto DOMINANTE.

Per capire che fine avesse fatto il carattere antagonista scomparso, seguendo sempre il nostro esempio, il colore bianco del fiore, Mendel fece AUTOIMPOLLINARE le piante della F1

Mendel osservò che negli individui della seconda generazione filiale (F2)

• Il 75% mostravano il carattere VIOLA della F1
• Il 25% mostravano il carattere BIANCO della generazione P che si era perso nella generazione F1

Il carattere che compare al 25% nella seconda generazione filiale viene detto RECESSIVO.

La ricomparsa delle piante con fiore bianco in questa generazione dimostrava che le piante della prima generazione filiale, pur senza mostrarlo,  conservavano questo carattere.

Per i sette caratteri studiati da Mendel di seguito sono indicate le varianti dominante e quella recessiva.